Правильная терапия муковисцидоза - основа качественной жизни ваших детей

Сравнительное исследование антибактериальной активности зарубежных препаратов мёда и отечественного нативного мёда

Мёд является многокомпонентным раствором с антибактериальными свойствами. Он обладает анти- бактериальным эффектом во многом благодаря осмотическому действию. Доказано, что раны, в которых обнаруживали S. aureus становились «стерильными» после начала лечения повязками с мёдом. Гиперосмолярность раствора мёда в ране негативно действует на микроорганизмы. На этом же принципе сейчас работают некоторые виды современного перевязочного материала (гидрогели и гидроколлоиды). Осмолярный эффект при этом зависит от степени экссудации в ране. При «сухой» ране он максимальный, при избыточной экссудации, в виду разведения мёда раневым отделяемым, концентрация сахаров снижается и антибактериальный эффект уменьшается [1, 5, 7].

С другой стороны, умеренное предварительное разведение мёда усиливает его антибактериальную активность. Оказалось, что при небольшом разведении мёда водой, в нём активируется ферментная система, конечным продуктом работы которой является перекись водорода. Показать важность этого дополнительного антибактериального действия можно, сравнив применение мёда и раствора глюкозы. В эксперименте изучено действие этих средств для лечения ожоговых ран у свиней, где мёд оказался эффективней. Другое клиническое исследование лечения глубоких пролежней показало отсутствие эффекта повязок с сахаром и полное заживление этих же пролежней за 6 недель после замены повязок с сахаром на повязки с мёдом. Концентрация перекиси водорода в мёде, наблюдаемая после разведения, оказывается равной примерно 1 ммоль/л. При этом мёд защищает ткани от негативно- го действия перекиси водорода, препятствуя реакции со свободным железом, результатом которой является появление свободных радикалов кислорода. Содержащиеся в мёде антиоксиданты также блокируют свободные радикалы. Известно, что в хронических ранах избыточная концентрация нейтрофилов приводит к увеличению концентрации свободных радикалов. Это, в свою очередь, усиливает миграцию нейтрофилов к очагу воспаления. Разорвать данный порочный круг могут содержащиеся в мёде антиоксиданты. Несмотря на то, что уровень перекиси водорода в мёде мал, его достаточно для антибактериального действия раствора. Это подтверждают данные исследования E. coli, в котором для прекращения роста колоний в среде было достаточно концентрации перекиси водорода 0,02-0,05 ммоль/л. Такая концентрация не оказывает негативно- го действия на фибробласты кожи человека [7, 9].

Ещё одним компонентом является метилглиоксаль, который обнаружен в различных концентрациях в мёде из разных источников. Мёд из Новой Зеландии – манука – содержит метилглиоксаль, который является производным содержащегося в мёде дигидроксиацетона. Считается, что именно этот компонент придаёт данному сорту мёда выраженную антибактериальную активность. Предложено ранжировать мёд из Новой Зеландии по этому уникальному фактору – UMF (Unique Manuka Factor), как по терапевтической эффективности. Концентрация метилглиоксаля может колебаться в широких пределах – от 38 до 761 мг/кг [2, 5, 9].

Существуют данные не только об антибактериальной активности мёда. Он может стимулировать Т- и В-лимфоциты из периферической крови в клеточной культуре при концентрации мёда всего в 0,1%. В концентрации 1% мёд в клеточной культуре способен стимулировать моноциты, высвобождать цитокины, интерлейкин-1, интерлейкин-6, фактор некроза опухолей. Эти вещества, как известно, активируют иммунный ответ и помогают бороться с инфекцией [1, 2, 7].

Сравнительное исследование антибактериальной активности зарубежных препаратов мёда и отечественного нативного мёда

Ещё одно свойство мёда, возможно, также усиливает его антибактериальные свойства. Высокая концентрация сахаров в мёде обеспечивает низкий уровень pH, что приводит к активации макрофагов. Значение pH отличается у мёда разных сортов и обыч- но находится в диапазоне от 3 до 4 [6, 9]. Таким образом, антимикробная активность мёда, возможно, объясняется сочетанием таких свойств как pH<4, высокая осмолярность, наличие перекиси водо- рода и метилглиоксаля [1]. Однако, как стало очевидно относительно не- давно, антимикробная активность мёда в наибольшей степени обусловлена антимикробными пептидами. Так, значительно продвинулись в изучении апидацина, который выделяет медоносная пчела. Модифицированный апидацин (Api88, Api137) ранее уже пока- зал эффективность in vitro против K. pneumonia и P. aerugnosa [3, 4, 8, 10].

Нам не удалось обнаружить в литературе современных данных об антибактериальной активности нативного российского мёда по отношению к актуальным штаммам, также как и работ, сравнивающих антибактериальную активность готовых местных антибактериальных препаратов (АМП) мёда и нативного мёда. В России не зарегистрированы подобные препараты для местного лечения раневых инфекций и в исследования были включены зарубежные антибактериальные мази и повязки. Цель исследования: сравнить антибактериальную активность препаратов мёда и нативного мёда в отношении коллекции штаммов с экстремальными фенотипами устойчивости к антимикробным препаратам, полученных из хирургических стационаров России.

Материалы и методы

Для исследования выбраны изоляты бактерий с известным профилем чувствительности к АМП и установленными генетическими детерминанта- ми устойчивости для мультирезистентных штаммов (табл. 1).

В данном исследования использовались 6 различных образцов мёда (табл. 2). Образец 2 производства Новой Зеландии из мёда манука и образец 3 производства Великобритании из мёда манука Новой Зеландии были приобретены в клинической сети г. Лондон (Великобритания). На момент исследования у препаратов не истёк срок годности и оба они рекомендованы в ряде стран Европы, а также в Канаде, Австралии и Новой Зеландии как препараты для местного лечения госпитальной раневой инфекции. Образцы 1, 5 и 6 являлись образцами мёда лета 2014 года из трёх районов Смоленской области, удалённых друг от друга на расстояние от 130 км до 300 км. Образцы предоставлены пчеловодами по просьбе лаборатории. Образец 4 – мёд из г. Ростов-на-Дону, безвозмездно переданный в лабораторию. На момент исследования мёду образцов 1, 5 и 6 было не менее 5 месяцев.

Определение чувствительности проводилось методом разведений в бульоне с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК) меда в отношении исследуемых микроорганизмов.

Процедура определения чувствительности проводилась по протоколу, для чего потребовалось про- вести ряд процедур. Приготовить раствор мёда с концентрацией 30% (масса/объем) в бульоне Мюллера-Хинтон (МХБ); для этого к навеске мёда постепенно добавлять необходимое количество МХБ (меньшее, чем конечный требуемый объем), тщательно перемешивая до полного растворения. Полученный раствор мёда перенести в мерный цилиндр достаточного объема. Довести объем раствора до требуемого конечного объема. Полученный раствор стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 микрона. Из полученного раствора мёда (с концентрацией 30%) приготовить ряд последовательных разведений в МХБ (табл. 4). Приготовленные растворы мёда внести в лунки микротитровальных 96-луночных планшетов; объем раствора в каждой лунке – 100 мкл. Суспензии каждого исследуемого изолята в стерильном 0,85% растворе хлорида натрия плотностью 0,5 по Мак Фарланду внести в планшеты при помощи автоматического многоточечного инокулятора Mast UriDot (Великобритания). Планшеты инкубировать в условиях обычной атмосферы при 35°С в течении 18- 24 часов. Для контроля качества определения чувствительности, параллельно с тестируемыми штаммами определяли МПК в отношении международных контрольных штаммов Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Минимальная концентрация, при которой не было выявлено признаков роста микроорганизма, расценивалась как МПК мёда в отношении данного изолята. МПК мёда выражена в процентах, так как препарат, сам являясь раствором, разводился начиная от 30% и ниже.

Сравнительное исследование антибактериальной активности зарубежных препаратов мёда и отечественного нативного мёда

Результаты и их обсуждение

Все 6 образцов мёда продемонстрировали антибактериальные свойства. Выбранный нами 30% раствор, как первый в ряду тестируемых, оказался эффективным антибактериальным средством в отношении всех штаммов всех образцов за исключением Enterobacteriaceae для образца 4 (мед из Ростова-на- Дону). Коммерческие препараты, содержащие мёд из Новой Зеландии (манука) продемонстрировали сходные между собой параметры и в анализе мы не будем их дифференцировать. Мёд из Смоленской области также показал близкие результаты при сравнении 3 образцов, что, возможно, связано с небольшой удалённостью источников мёда друг от друга (до 300 км). От- личные от всех и худшие результаты в исследовании были получены для препарата 4. Это может быть связано с особенностями местности, где был собран мёд или с нарушениями производства, хранения и транспортировки меда из Ростова-на-Дону, о чём исследователям достоверно неизвестно. Мы также не можем исключить, что данный образец мог оказаться более старым, чем образцы из Смоленска.

Результаты исследования представлены в табл. 3.

Сравнительное исследование антибактериальной активности зарубежных препаратов мёда и отечественного нативного мёда

Образцы из Лондона и Смоленска показали лучшую активность в отношении грамположительной флоры, чем для грамотрицательной. Некоторые штаммы MRSA и MSSA погибали при 1,88% МПК, большинство при 3,75% и 7,5% для образцов 1, 5 , 6 и при 5-7,5% МПК для образцов 2 и 3. В отношении грамотрицательной флоры образцы манука были эффективны при МПК от 7,5% до 30%, преимущественно в диапазоне 10-20%. Образцы мёда из Смоленской области подавляли рост грамотрицательной флоры при МПК от 5% до 30%, большинство штаммов – при 10%.

В предыдущих зарубежных исследованиях манука показал МПК по отношению к MRSA 2-8% [2], VRE 5-20% [2, 9], Pseudomonas 5,5-9% [6]. В настоящем исследовании для Pseudomonas продемонстрировано 15-20%, для MRSA 5-15%, а 80% изолятов показали результат МПК 5-10%. Таким образом, реальные данные МПК зарубежных препаратов на основе манука несколько отличаются от литературных данных и оказались хуже, чем ожидалось.

Все 6 образцов показали эффективность in vitro для экстремально резистентной коллекции штаммов, собранной со всей России от пациентов с госпитальными хирургическими инфекциями. Концентрации для подавления грамположительной флоры требовались в 2-4 раза ниже, чем для грамотрицательной. При этом антибактериальные свойства мёда не зависели от механизма резистентности. В исследовании приняла участие коллекция штаммов, полученная из хирургических стационаров России с известными механизма- ми резистентности. Результаты тестирования зависели только от препарата меда, что косвенно подтверждает большую роль антимикробных пептидов для которых показан эффект независимо от механизма резистентности.

Препарат 4 (г. Ростов-на-Дону) вероятно не был удачным выбором, так как исследователи не могли достоверно отследить сбор и путь препарата в Смоленск. Препараты 2 и 3 (Новая Зеландия) показали худшие характеристики, чем мёд из Смоленска. Возможно, это связано с тем, что коммерческий препарат кроме стерилизации фильтрацией прошёл стерилизацию γ-облучением. Гамма-лучи могли разрушить часть молекул антимикробных пептидов и тем самым уменьшить антибактериальные свойства препаратов. Однако, коммерческие препараты, прошедшие клинические исследования и получившие рекомендации всё же оказались достаточно эффективными и могут рассматриваться как средства борьбы с госпитальной раневой инфекцией при местном применении. Препараты мёда из Смоленской области продемонстрировали лучшие результаты для всех изолятов. Мёд в образцах 1, 5 и 6 был относительно свежим и не прошёл γ-стерилизацию, сохранив активность всех входящих в его состав компонентов.

Вывод

Мёд из Смоленского региона может быть рас- смотрен как ресурс для создания новых эффективных местных препаратов для лечения раневой инфекции, вызванной полирезистентной флорой. Для лучшего понимания механизмов антибактериального действия меда необходимо продолжить работу в направлении выделения из него антимикробных пептидов с возможным созданием нового класса антибактериальных препаратов. В условиях необходимости импортозамещения лекарственных средств мы располагаем необходимым ресурсом для лечения мультирезистентных раневых инфекций и доказательной базой, позволяю- щей начать работу в данном направлении.

Список литературы
1. Привольнев В.В., Даниленков Н.В. Мёд в лечении ин- фицированных ран. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2014; 16: 3: 219-228.
2. Allen K.L., Hutchinson G., Molan P.C. The potential for using honey to treat wounds infected with MRSA and VRE. First World Wound Healing Congress, 2000; Melbourne, Australia.
3. Ahmad A., Ahmad E., Rabbani G., Haque S., Arshad M., Khan R.H. Identification and design of antimicrobial peptides for therapeutic applications. Curr. Protein Pept. Sci., 2012; 13: 211–223.
4. Berthold N., Hoffmann R. Cellular uptake of apidaecin 1b and related analogs in Gram-negative bacteria reveals novel antibacterial mechanism for proline-rich antimicrobial peptides. Protein Pept. Lett., 2014; 21: 391-398.
5. Blair S.E. The unusual antibacterial activity of medicalgrade Leptospermum honey: antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2009; 28: 1199–1208.
6. Cooper R.A., Molan P.C. The use of honey as an antiseptic in managing Pseudomonas infection. J. Wound. Care, 1999; 8: 161-164.
7. Cooper R.A., Molan P.C., Harding K.G. Antibacterial activity of honey against strains of Staphylococcus aureus from infected wounds. J. R. Soc. Med., 1999; 92: 283-285.
8. Czihal P., Knappe D., Fritsche S. Api88 is a novel antibacterial designer peptide to treat systemic infections with multidrug-resistant Gram-negative pathogens. ACS Chem. Biol., 2012; 20: 7: 1281-1291.
9. Molan P.C. The evidence and the rationale for the use of honey as a wound dressing. Wound Practice and Research 2011; 19: 204–220.
10. Yi H.Y., Chowdhury M., Huang Y.D., Yu X.Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014; 98: 5807-5822.



0

Автор публикации

не в сети 14 часов

Юстас

Аватар 15
Комментарии: 7Публикации: 334Регистрация: 01-07-2019

Добавить комментарий

Авторизация
*
*
Регистрация
*
*
*
Генерация пароля