Правильная терапия муковисцидоза - основа качественной жизни ваших детей

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Источник. С.А.Красовский, Н.В.Петрова, А.А.Степанова, М.В.Усачева, В.А.Самойленко, Е.Л.Амелина, В.С.Никонова
Клиническое течение заболевания у взрослых больных муковисцидозом – носителей “мягких” мутаций, 2012г. – ФГБУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России: 105077, Москва, ул. 11-я Парковая, 32, корп. 4; 2 – ГУ “Медико-генетический научный центр РАМН”: 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

Муковисцидоз (МВ) – самое частое моногенное заболевание с аутосомнорецессивным типом наследования. Данная патология, вызванная мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза (МВТР), приводит к дисфункции хлорного канала, расположенного в апикальной части мембран экзокринных желез. В результате секрет становится вязким и обезвоженным, что обусловливает ряд патологических процессов в различных органах и системах. Так, в бронхолегочной системе ведущим является присоединение патологической микрофлоры с развитием картины гнойного, а в последующем гнойнообструктивного бронхита с формированием бронхоэктазов; в поджелудочной железе – блокада протоков с развитием аутолиза ее ткани; в печени – канальцевый холестаз и изменение литогенности желчи с формированием цирроза и желчекаменной болез ни; в семявыносящих протоках – их частичная или полная обтурация с развитием олигоили азооспермии. Выраженность проявлений в различных органах разная, несмотря на это, тяжесть состояния, инвалидизация и смертность в подавляющем большинстве случаев обусловлена степенью поражения органов дыхания. Ген МВТР располагается на длинном плече 7й хромосомы, в области q31, имеет протяженность 250 000 пар нуклеотидных оснований, включает в себя 27 экзонов, состоит из 2 нуклеотидсвязывающих, 2 трансмембранных доменов и 1 центрального внутриклеточного регуляторного домена и функционирует как цАМФзависимый хлорный канал. В настоящее время выделено > 1 900 мутаций и полиморфизмов гена. Они располагаются на всем его протяжении, как в смысловых и интронных областях, так и в регуляторной области. Мутации гена МВТР, согласно европейскому консенсусу, подразделяются на 5 классов в зависимости от механизма, нарушающего функцию белка (табл. 1).

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Мутации I–III классов (т. н. “тяжелые”) ассоциированы c более глубоким нарушением функции, IV–V классов (т. н. “мягкие”) – с сохранением остаточной функции белка МВТР. В компаундгете розиготном состоянии эффект “мягкой” мутации доминирует над эффектом “тяжелой”. Генотип, включающий в себя 2 мутации I–III классов, формирует “тяжелый” фенотип, ассоциированный с ранней панкреатической недостаточностью; генотип с хотя бы 1 “мягкой” мутацией формирует “мягкий” фенотип, для которого характерна сохранная функция поджелудочной железы или позднее развитие панкреатической недостаточности. Среди взрослых пациентов доля “мягких” фенотипов значительно выше, чем среди детей, что определило актуальность настоящей работы.

Целью проведенного одномоментного исследования явилось выявление особенностей клинического течения заболевания у взрослых больных с “мягким” генотипом. Исследовалось влияние “мягкого” генотипа на диагностику МВ, респираторный и питательный статус, микробиологический профиль бронхиального дерева, наличие и частоту различных легочных и внелегочных осложнений, а также на выживаемость больных. Материалы и методы В одномоментный анализ были включены 382 человека (195 мужчин и 187 женщин), в т. ч. 89 умерших пациента, которые наблюдались в лаборатории муковисцидоза ФГБУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России с ноября 1992 по ноябрь 2012 г. Критерии включения в исследование были следующими:
• диагноз МВ, установленный на основании клинической картины и данных положительной потовой пробы;
• возможность идентификации генотипа: для “тяжелого” – обязательное наличие мутаций I–III классов, для “мягкого” – идентификация хотя бы 1 мутации IV–V классов.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DNAPrep100 (DIAtomтм, Россия) по протоколу производителя. Для исследования 11 инсерционно / делеционных мутаций (CFTRdele2,3, F508del, I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, L138ins, 604insA, 3944delTG) использовали методику мультиплексной амплификации. Для регистрации 7точковых мутаций (G542X, W1282X, N1303K, R334W и 3849+10kbC>T, S1196X, 621+1G>T, E92K) использовали метод аллельспецифичного лигирования с последующей амплификацией. У 15 больных проведено определение нуклеотидной последовательности методом прямого автоматического секвенирования на приборе фирмы Applied Biosystems (США) согласно протоколу фирмы производителя. По данным анамнеза (расспрос и информация из выписок амбулаторной карты и стационаров) оценивались следующие параметры: возраст диагноза и манифестации бронхолегочного и кишечного синдромов, хлориды пота при проведении потового теста, микробиологический профиль нижних дыхательных путей, наличие легочных и внелегочных осложнений (легочная гипертензия, гипоксемическая дыхательная недостаточность, сахарный диабет, цирроз печени, желчекаменная болезнь, низкая костная масса, меконеальный илеус). Определялись антропометрические показатели (рост, масса тела). Нутритивный статус оценивался с помощью индекса массы тела (ИМТ, кг / м2 ); низкими считались показатели < 18,5 кг / м2 . Исследование функции внешнего дыхания проводилось одним специалистом в соответствии с критериями Европейского респираторного и Американского торакального обществ (ERS / ATS) на аппарате Master Screen Body (Erich Jaeger, Германия). Оценивались следующие показатели: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1ю с (ОФВ1). Изменение или сохранение функции поджелудочной железы подтверждалось на основании клинических данных (наличие или отсутствие стеатореи), исследования копрограммы и / или эластазы1 кала, наличием панкреатической недостаточности, которая определялась по присутствию в копрограмме достаточного количества нейтрального жира и / или уровню элатазы1 < 200 мкг / г. Сатурация гемоглобина кислородом (SpO2) определялась методом пульсоксиметрии после достаточного отдыха в положении сидя с помощью пульсоксиметра Nonin (США).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных программ SPSS (SPSS Inc., США). Данные анализировались на соответствие распределения значений изучаемого признака закону нормального распределения. В зависимости от вида распределения мерами центральной тенденции и рассеяния служили среднее значение (М) ± стандартное отклонение (SD) или медиана (Ме) (интерквартильный размах). При сравнении средних значений или медиан применялись tкритерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни. Для оценки различий категориальных переменных в подгруппах использовались χ2 или точный метод Фишера. Выживаемость оценивалась с помощью анализа Каплана–Майера, достоверность различий между различными группами определялась с помощью Log Rank Test.

Результаты и обсуждение

Этапы исследования представлены на рис. 1.

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Критериям включения соответствовали 270 пациентов, что составило 70,7 % от общего числа больных и 74,2 % от числа пациентов, которым было проведено генетическое исследование. “Мягкий” генотип определен у 86 больных (23,6 % от общего числа генотипированных), “тяжелый” – у 184 пациентов (50,5 % от числа генотипированных). Структура генотипов представлена в табл. 2.

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Наиболее частым “тяжелым” генотипом являлся F508del/F508del, который был выявлен у 88 больных (48 % от числа “тяжелых” генотипов и 24,2 % от числа больных, которым был проведен ге нетический анализ). F508del явилась самой частой “тяжелой” мутацией с аллельной частотой 68 % среди пациентов с “тяжелыми” генотипами и 26,2 % среди больных с “мягкими” генотипами. Самым частым “мягким” генотипом явился F508del/3849+10kbC>T, выявленный у 26 пациентов (30,2 % от общего числа “мягких” генотипов и 7,2 % от всех генотипированных больных), а аллельная частота мутации 3849+10kbC>T составила 25,0 % в группе “мягких” генотипов и 8,0 % среди всех пациентов, соответствовавших критериям включения. В результате проведения прямо го автоматического секвенирования на небольшой выборке были выявлены следующие “мягкие” и “тяжелые” мутации: S1159P, 327216T>A, 3849G>A и W1282R, 1898+1G>A, 4015delA, S466X, K329X, K710X, L1335P, 3321delG, 2183AA>G, 1367del5, 6221G>C, 7121G>T, СFTRdup6b10, G461E, Y569H, D579Y, K598ins, D572N. Мутации W1282R, 1898+ 1G>A, 4015delA были обнаружены неоднократно. В структуре “мягких” генотипов было выявлено 10 “мягких” мутаций. Результаты сравнительного анализа “мягких” и “тяжелых” генотипов представлены на рис. 2 и в табл. 3–5.

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций
Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Для “тяжелых” генотипов характерно ассиметричное распределение возраста установления диагноза с доминированием первых лет жизни. При “мягком” генотипе распределение возраста установления диагноза, наоборот, более равномерное с наибольшей частотой в подростковом возрасте. Диагноз МВ, устанавливаемый во взрослом возрасте, ассоциирован в основном с “мягким” генотипом (“тяжелый” генотип встречается намного реже). Обращает на себя внимание более низкий уровень хлоридов пота и более поздняя манифестация симптоматики со сто роны органов дыхания у пациентов с “мягким” генотипом. Доля больных старше 40 лет в группе с “мягкими” генотипами составила 7,1 %, в то время как среди “тяжелых” – 0,5 %, что, в свою очередь, определило более старший возраст пациентов с “мягкими” генотипами. Из 7 пациентов старше 40 лет 6 имели “мягкий” генотип.

При сопоставлении глубины поражения и осложнений со стороны органов дыхания и желудочно-кишечного тракта наиболее выраженные изменения отмечены в частоте панкреатической недостаточности, сахарного диабета, цирроза печени и кишечной непроходимости. Аналогичных симметричных изменений со стороны органов дыхания получено не было. Анализ микробиологического профиля дыхательных путей выявил доминирование в обеих группах грамотрицательной флоры с преобладанием Pseudomonas aeruginosa. В структуре грамотрицательной флоры отмечена достоверно бóльшая частота высева Burkholderia сepacia среди пациентов с “тяжелым” генотипом. Анализ выживаемости представлен на рис. 3.

Клиническое течение заболевания, зависимость от мутаций

Из числа пациентов с “мягкими” генотипами умерли 12 больных (средний возраст смерти – 25,7 ± 7,2 лет), с “тяжелыми” – 31 человек (средний возраст смерти – 22,6 ± 3,9 года). Медиана выживаемости в группе пациентов с “мягкими” генотипами составила 40,2 года, что достоверно выше, чем в группе больных с “тяжелыми” генотипами, – 31,0 год (Log rank test, p = 0,028).

Обсуждение

Впервые в России был проведен анализ, связанный с поиском генофенотипических особенностей на большой выборке взрослых больных МВ. Работы 1990х гг., включающие детей, страдающих МВ, были посвящены изучению влияния отдельных мутаций на клиническое течение болезни. В частности, в 1997 г. Л.Ф.Ковалевой оценивалось влияние гомо и гетерозиготного носительства мутации F508del на различные клинические проявления заболевания. Похожие исследования были проведены в последующем Л.А.Желениной и Н.Ю.Каширской на больших выборках детей, страдающих МВ. Во всех этих работах оценивалось влияние отдельных мутаций гена МВТР на клиническое течение МВ. Наиболее близкой нашему исследованию является работа Н.В.Петровой, в которой также были подвергнуты сопоставлению “мягкие” и “тяжелые” генотипы. Однако определенным ограничивающим обстоятельством этого исследования явилось включение в анализ только пациентов детского возраста. Вероятно, это повлияло на объем выборок (257 “тяжелых” генотипов и всего лишь 23 “мягких”, т. е. более чем 11кратное доминирование “тяжелых” генотипов), что, как отмечает автор, могло сказаться на статистической обработке данных и полученных взаимосвязях. В нашей работе это соотношение составляет примерно 2 : 1. Кроме того, исключение из анализа взрослых больных не только не могло повлиять на оценку выживаемости, но и, вероятно, лимитировало адекватную оценку легочных и внелегочных осложнений, т. к. их частота значительно возрастает именно во взрослом возрасте.

Проведенная нами работа, как и большинство исследований на данную тему в мире, показало некоторые особенности течения заболевания у носителей “мягких” мутаций. Эти особенности обусловлены как доминированием “мягкой” мутации над “тяжелой”, так и разной чувствительностью тканей к дисфункции МВТР. Известно, что наибольшая чувствительность – у семявыводящих протоков, меньшая – у бронхолегочной системы, и наконец, поджелудочная железа является тем органом, где дисфункция гена МВТР оказывает наименьшее влияние. В связи с этим все больные в нашем исследовании имели поражение легких, но с “тяжелыми” генотипами – еще и органов желудочно-кишечного тракта.

Значительно более позднее установление диагноза у больных с “мягким” генотипом обусловлено, прежде всего, отсутствием симметричного поражения легких и органов пищеварения в детстве и зачастую менее ярко выраженным дебютом гнойно-обструктивного бронхита. Также определенную роль играет неярко выраженное повышение хлоридов, а в ряде случаев – сомнительный и даже отрицательный результат при проведении потового теста, что является проявлением менее выраженной дисфункции белка МВТР. В этом случае особым “коварством” обладает мутация 3849+10kbC>T, при которой примерно в половине случаев, по данным разных авторов, наблюдается сомнительный или отрицательный потовый тест. Эта самая частая “мягкая” мутация в мире приводит к возникновению скрытого сайта инициации транскрипции, в результате чего образуется матричная РНК с дополнительным экзоном, кодирующим 38 аминокислот. Однако некоторая часть транскриптов мРНК продолжает соединяться правильно, что приводит к незначительному нарушению функции белка МВТР. Уникальность данной мутации состоит еще и в том, что при ее наличии большинство мужчин с МВ не являются бесплодными, в то время как при других генетических комбинациях, в т. ч. при “мягких” генотипах, отмечается азооспермия. Ярким примером поздней диагностики среди наших больных является случай установления диагноза у мужчины с клинической картиной диффузных бронхоэктазов, у которого неоднократно подозревался МВ и проводились потовые тесты, однако результаты были отрицательными или сомнительными. Отсутствие повышения хлоридов пота, наличие нескольких биологических детей и отсутствие панкреатической недостаточности обусловливало в свое время неправильное заключение врачей, исключивших диагноз МВ. Эти обстоятельства привели к тому, что правильный диагноз был уставлен у пациента только в возрасте 59 лет, после обнаружения генотипа 3849+10kbC>T/W1282X.

Нами показана тесная взаимосвязь тяжести генотипа с различными проявлениями поражения органов пищеварения и отсутствие корреляции с выраженностью поражения легких. Аналогичные данные были продемонстрированы в большинстве зарубежных исследований. Отсутствие очевидных взаимосвязей генотипа с поражением бронхолегочной системы обусловлено влиянием различных внешних факторов (активностью и приверженностью к терапии, различной инфекционной составляющей бронхолегочной системы, социальным статусом и т. д.). Другим фактом, вероятно, имеющим определенное значение в получении настоящих результатов о симметричности поражения легких у пациентов обследуемых групп, является факт поздней, а иногда очень поздней диагностики заболевания среди индивидов с “мягкими” генотипами. Возможно, если бы диагноз был установлен этим пациентам в первые годы жизни, как подавляющему большинству больных с “тяжелыми” генотипами, и, соответственно, раньше начиналось бы комплексное лечение и наблюдение, то тяжесть поражения органов дыхания при “мягких” генотипах была менее выраженной, чем при “тяжелых”. Косвенным доказательством этого предположения является полученный нами результат о достоверно большей доле пациентов, инфицированных B. cepacia, среди носителей “тяжелых” генотипов. В ряде зарубежных работ также показано, что пациенты с “мягкими” генотипами имеют более благоприятный микробиологический фон и чаще инфицированы S. aureus. Полученный результат можно объяснить более тяжелой дисфункцией МВТР, приводящей к более глубокому нарушению реологических свойств мокроты и усилению ее вязкости, что, в конечном счете, вероятно, влияет на “податливость” дыхательных путей к инфицированию патологическими микроорганизмами. Наверное, эти обстоятельства привели к тому, что в некоторых работах зарубежных авторов все таки отмечены преимущества респираторного статуса у “мягких” генотипов.

Результатом нашей работы явилось выделение больных с “тяжелым” генотипом не только как пациентов с панкреатической недостаточностью, но и как пациентов с определенным риском развития других различных осложнений со стороны органов пищеварительной системы. Такие серьезные осложнения МВ, как сахарный диабет, цирроз печени и кишечная непроходимость, встречались только в группе с “тяжелыми” генотипами. С другой стороны, желчекаменная болезнь развивалась симметрично в обеих группах, это свидетельствует о том, что и у пациентов с “мягкими” генотипами имеется нарушение литогенности желчи, приводящее к камнеобразованию. Частота остеопороза, как указано в большинстве зарубежных работ, сопоставима среди групп, обусловлено это, прежде всего, тесной взаимосвязью состояния костной массы с функцией легких. Такой же тесной корреляцией функции бронхолегочной системы и питательного статуса можно объяснить отсутствие различий ИМТ между группами. Вторым важным обстоятельством, объясняющим отсутствие этих различий, возможно, является адекватная терапия препаратами поджелудочной железы. Более глубокая дисфункция белка МВТР у носителей “тяжелых” генотипов, приводящая к более серьезному поражению органовмишеней, включая более частый высев В. сepacia и достаточно высокий риск тяжелых осложнений со стороны органов пищеварения, приводит к более низкой выживаемости таких пациентов. Аналогичные результаты были получены в США, в исследовании E.F.McCone et al., по веденном на большой выборке больных. Среди генотипов, включающих мутации I–III классов, показатель смертности в 2 раза выше, чем среди генотипов хотя бы с 1 мутацией IV–V класса. Авторы сделали вывод, что генотип является независимым фактором прогноза жизни больного.

Заключение

1. Для больных МВ с “мягким” генотипом характерно позднее установление диагноза.
2. Респираторная функция, как и питательный статус у пациентов с “мягким” генотипом не отличаются от “тяжелых” генотипов.
3. “Мягкий” генотип обладает протективным влиянием, препятствующим развитию сахарного диабета, цирроза печени и кишечной непроходимости, но не желчекаменной болезни и низкой костной массы.
4. У пациентов с “мягкими” генотипами наблюдается достоверно лучшая выживаемость по сравнению с “тяжелыми” генотипами.

Информация об авторах
Красовский Станислав Александрович – к. м. н., научный сотрудник лаборатории муковисцидоза ФГБУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России; тел.: (495) 4657415; email: sa_krasovsky@mail.ru
Петрова Ника Валентиновна – д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии ГУ “Медико-генетический научный центр РАМН”; тел.: (499) 3206090; email: npetrova63@mail.ru Степанова Анна Александровна – к. м. н., научный сотрудник лаборатории ДНК диагностики ГУ “Медико-генетический научный центр РАМН”; тел.: (499) 3248110; email: сany@yandex.ru
Усачева Мария Валерьевна – клинический ординатор ФГУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России; тел.: (495) 4657415; email: usamariya@yandex.ru,
Самойленко Виктор Александрович – научный сотрудник лаборатории муковисцидоза ФГУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России; тел.: (495) 4657415; email: samoilenkov@mail.ru
Амелина Елена Львовна – к. м. н., заведующая лабораторией муковисцидоза ФГУ “НИИ пульмонологии” ФМБА России; тел.: (495) 46553 84; email: eamelina@mail.ru
Никонова Виктория Сергеевна – к. м. н., врач-генетик научно-клинического отдела муковисцидоза ГУ “Медико-генетический научный центр РАМН”; тел.: (499) 3254904; email: nikonovavs@mail.ru

0

Автор публикации

не в сети 2 дня

Юстас

Аватар 15
Комментарии: 7Публикации: 334Регистрация: 01-07-2019

Добавить комментарий

Авторизация
*
*
Регистрация
*
*
*
Генерация пароля