Правильная терапия муковисцидоза - основа качественной жизни ваших детей

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)

Источник. https://www.nature.com/articles/s41598-018-37636-x
06.02.2019

Муковисцидоз (МВ) является наследственным заболеванием из-за мутаций в гене CFTR и вызывает смертность у людей в основном из-за респираторных инфекций, вызванных Pseudomonas aeruginosa. В предыдущей работе мы использовали фаговую терапию, которая представляет собой лечение смесью фагов, для активного противодействия острым инфекциям P. aeruginosa у мышей и личинок Galleria mellonella.
В этой работе мы применяем фаговую терапию для лечения инфекций P. aeruginosa PAO1 на модели рыбок данио CF. Структура канала CFTR эволюционно законсервирована между рыбой и млекопитающими, а эмбрионы рыбок данио cftr с потерей функции обнаруживают фенотип, который повторяет заболевание человека, в частности, при разрушении поджелудочной железы. Мы показываем, что фаговая терапия способна снизить летальность, бактериальную нагрузку и противоспалительный ответ, вызванный инфекцией PAO1. Кроме того, введение фага снимает конститутивное воспалительное состояние эмбрионов МВ. Насколько нам известно, это первый раз, когда фаговая терапия используется для лечения инфекций P. aeruginosa на модели животных с МВ. Мы также обнаружили, что лечебный эффект против инфекций PAO1 улучшается путем сочетания фагов и лечения антибиотиками, открывая полезный терапевтический подход, который может уменьшить дозы антибиотиков и время их введения.

Одной из самых серьезных чрезвычайных ситуаций в области здравоохранения за последние десятилетия является повторное появление бактериальных инфекций. Это серьезное последствие является следствием быстрого распространения резистентности к применяемым в настоящее время антибиотикам среди патогенных бактерий, а также сложности с обнаружением новых эффективных антибиотиков. Кроме того, появление и распространение изолятов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) делает ситуацию еще хуже. Таким образом, срочно необходимы альтернативные методы лечения, и бактериофаги (фаги), естественные враги бактерий, которые могут стать эффективным решением.

По сравнению с антибиотиками, фаги обладают рядом преимуществ: во-первых, они заражают только очень специфических бактериальных хозяев, избегая повреждения здоровой комменсальной микробиоты; во-вторых, фаги самостоятельно контролируют свою дозу: они размножаются, когда и где присутствуют целевые бактериальные штаммы-хозяева, увеличивая их количество в месте заражения только до тех пор, пока целевые бактерии будут уничтожены; наконец, фаги способны убивать также бактерии MDR.

Идея использования фагов против бактерий не нова: первые попытки были сделаны почти столетие назад. Однако из-за недостатка знаний о репродуктивном цикле фагов терапия чередовала успехи и неудачи, и с появлением антибиотиков фаги отошли на второй план в западном мире, хотя они в настоящее время используются на востоке. В настоящее время многие детали размножения фагов были полностью выяснены, что облегчает их использование в терапии, и были предложены рекомендации по приготовлению и применению фагов в качестве терапевтических агентов.

В последние годы все больше сообщений об эффективности фаговой терапии в борьбе с бактериальными инфекциями было предоставлено, начиная от легочных инфекций Klebsiella pneumoniae, кератита Pseudomonas aeruginosa или мышей, инфицированных P. aeruginosa. В недавнем отчете мы выделили и охарактеризовали вирулентные фаги, способные инфицировать P. aeruginosa, и упорядочили их геномы, чтобы исключить присутствие любого гена, потенциально вредного для терапии. Различные фаги смешивали в коктейле и использовали для лечения острых инфекций P. aeruginosa у мышей и личинок Galleria mellonella.

Фаговая терапия была успешной в обеих модельных системах. Более того, мы обнаружили, что эффективность терапии была улучшена с использованием коктейля с фагом по сравнению с использованием одного фага, что является вероятным следствием увеличения диапазона “хозяина” и снижения частоты бактерий, устойчивых к фагам, как сообщалось Chadha et al.

Инфекции P. aeruginosa особенно серьезны у пациентов, страдающих муковисцидозом (МВ), являющимся одной из основных причин смертности и заболеваемости. Муковисцидоз – это рецессивное генетическое заболевание, вызванное мутацией гена, кодирующего трансмембранный регулятор муковисцидоза (CFTR), хлорид-ионный канал. Из-за широко распространенного распределения белкового канала CFTR CF поражает множество органов, включая легкие, желудочно-кишечный тракт, печень, мужской репродуктивный тракт и поджелудочную железу. Одним из основных осложнений у пациентов с МВ является хроническая инфекция дыхательных путей, главным образом вызванная P. aeruginosa, и, как следствие, пациенты с МВ подвержены частым антибиотикотерапиям для борьбы с инфекциями. Положительные результаты острых инфекций P. aeruginosa, полученные в результате фаговой терапии, побудили нас к дальнейшему изучению его использования на фоне МВ, и мы выбрали рыбку данио (Danio rerio) в качестве модельной системы для ее проверки. Действительно, рыбка данио представляет собой хорошую модель для CF, так как канал Cftr имеет структуру, аналогичную человеческому CFTR, а эмбрионы с нокдауном cftr обладают специфической чувствительностью к инфекции PAO1, что соответствует чувствительности пациентов с CF к этой бактерии.

Действительно, хотя у рыб нет легких, основного пораженного органа от инфекции P. aeruginosa как у пациентов с МВ, зато у них есть муцины – белки, сверхэкспрессируемые, как в легких пациентов с МВ. Муцины рыбок данио являются высоко гомологами муцинов человека с точки зрения организации геномных и белковых доменов. Это наблюдение вместе с доказательствами развития микроколоний P. aeruginosa, предшественников биопленки у рыбок данио, делают рыбок данио хорошей моделью для изучения инфекции P. aeruginosa во всех органах, кроме легких. Кроме того, нарушение регуляции функции cftr у рыбок данио вызывает фенотип, который отражает другие дефекты, присутствующие при заболевании человека, такие как тяжелая дисфункция поджелудочной железы, не наблюдаемая у модели мыши с CF и гематопоэтические дефекты, которые могут объяснять анемию, представленную пациентами с CF. У рыбок данио есть дополнительное преимущество, так как ему не хватает адаптивного иммунного ответа в течение первых 4–6 недель жизни, что представляет собой идеальную модель для изучения врожденного иммунитета, который является критическим механизмом защиты при инфекциях легких человека. Действительно, было продемонстрировано, что распознавание патогенных микроорганизмов и реакция на воспаление посредством высвобождения цитокинов происходит сходным образом у рыбок данио и людей.

В этой работе, используя эмбрионы рыбок данио cftr с потерей функции (CF эмбрионов), мы демонстрируем, что фаговая терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa. Кроме того, мы показываем, что благодаря сочетанию фагов и лечения антибиотиками лечебный эффект улучшается, что позволяет предположить, что введение фагов вместе с антибиотиками может снизить дозы антибиотиков и время их введения.

Результаты работы

Pseudomonas aeruginosa PAO1-инфекция эмбрионов рыбок данио. Заражение PAO1 проводили у эмбрионов рыбок данио, через 48 часов после заражения (hpi) путем микроинъекции в проток Кювье приблизительно 30 колониеобразующих единиц (КОЕ) / эмбрионов, как описано ранее. Бактериальная дисперсия внутри зародыша произошла немедленно, что оценивалось по исчезновению метки красителя, совместно введенной с бактериальной суспензией. Распределение флуоресцентных бактерий внутри эмбрионов сопровождалось микроскопией: как показано на рис. 1, а, при 20 hpi бактерии могут быть визуализированы в различных органах эмбрионов, что указывает на то, что бактериальная инфекция может распространяться по всему эмбриону. Кроме того, мы подтвердили, что инфекция PAO1 была распознана иммунной системой хозяина. Микроинъекцией конструкции tol2 (mpeg1: mCherry), которая маркирует макрофаги, мы наблюдали их миграцию в сторону GFP-положительного PAO1 и что бактерии были поглощены макрофагами (Fig. 1b).

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Заражение эмбрионов рыбок данио PAO1.
(а) Бактерии, инъецированные PAO1-GFP, визуализировали в разных районах эмбриона при 20 hpi. Цнс: центральная нервная система. Масштабная линейка указывает на 100 мкм.
(б) Инъекция плазмиды tol2 (mpeg1: mcherry) позволила визуализировать красные макрофаги, мигрирующие в направлении зеленых бактерий PAO-GFP. Начиная с 10 hpi, каждые 15 минут делались разные изображения одного и того же участка ствола. Шкала бар показывает 20 мкм.

Генерация модели CF рыбок данио
Чтобы получить фон CF, в котором подтверждается эффективность фаговой терапии против инфекций PAO1, мы генерировали эмбрионы рыбок данио cftr с потерей функции (эмбрионы CF) путем инъекции морфолиносов cftr, ранее использовавшихся и охарактеризованных. У эмбрионов обнаружены уже описанные фенотипы. Действительно, с помощью анализа гибридизации in situ мы продемонстрировали, что положение внутренних органов, таких как сердце, печень и поджелудочная железа, было ухудшено у эмбрионов МВ через 48 часов после оплодотворения (hpf). Сердце, визуализируемое зондом сердечной миозиновой легкой цепи 2 (cmlc2), обычно имеет левую петлю. Действительно, процентное содержание эмбрионов WT было: 90% левого, 10% среднего и 0% правого сердца (N = 50). Напротив, у эмбрионов МВ процентное соотношение составляло: 51% с левой петлей, 37% с серединой и 12% с правой петлей сердца, что указывает на дефект в петле сердца (Fig. 2a). Кроме того, нормальное левое положение печени, визуализированное с помощью прокс1а-зонда, было нарушено при МВ: 96% левой печени при ЗТ по сравнению с 57% левой печени у эмбрионов МВ через 48 часов после оплодотворения (N = 50) (рис. 2b) ). Кроме того, у эмбрионов CF наблюдается задержка иммунного ответа после бактериальной инфекции по сравнению с WT, о чем свидетельствует значительное снижение активации TNF-α и IL-β при 8 hpi (Fig. 2c). Чтобы удостовериться, что PAO1 был способен формировать биопленку, типичную для колонизации легких CF, мы инъецировали около 100 КОЕ PAO1 в желудочек заднего мозга эмбрионов рыбок данио из 24 hpf, как сообщили Rocker и коллеги, и наблюдали колонизацию бактерий с помощью анализа временных кругов в конфокальная микроскопия (Suppl. Video S1). В 18 hpi несколько эмбрионов были визуализированы в эмбрионах, что указывает на то, что PAO1 начал формировать биопленку. Интересно, что площадь микроколоний, образующихся у эмбрионов CF, была выше, чем у эмбрионов WT (Fig. 1d).

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Валидация CF эмбрионов. (a, b) Нарушение положения внутреннего органа у эмбрионов с инъекцией МВ.
(а) Нормальная петля сердца слева (вентральное изображение эмбриона, визуализированное с помощью методов гибридизации in-situ cmlc2) и
(б) нормальное левое положение печени (стрелки, вид спины эмбриона) визуализировались с помощью методов гибридизации prox-in-in-situ), были повреждены у эмбрионов с инъекцией CF по сравнению с контрольной группой. Шкала столбцов показывает 100 мкм. лив: печень; р: поджелудочная железа.
(c) Индукция TNF-α и IL-β. Уровни экспрессии, измеренные с помощью анализа RT-КПЦР при 8 hpi, у эмбрионов WT и CF с 48 часами после оплодотворения, инъецированных PAO1 (+ PAO1), приведены относительно средних уровней, измеренных в контрольных инъекциях. Один двусторонний t-критерий: t [4] = 7,62, p = 7,9E10-4 (TNF-α); t [4] = 15,26, p = 5,4E10-5 (IL-β).
(d) образование микроколоний PAO1 в желудочке заднего мозга эмбрионов WT и CF рыбок данио. Количество микроколоний на фоне МВ при 18 hpi было выше по сравнению с братьями и сестрами WT, которым вводили такое же количество PAO1 (100 КОЕ). Масштабная линейка указывает на 100 мкм. hv: желудочек заднего мозга.

Валидация фаговой терапии против инфекции PAO1 у эмбрионов WT и CF у рыбок данио

Инфицирование PAO1 на эмбрионах WT и CF рыбок данио осуществляли, как описано выше, с инъекцией в протоки Кювье при 48 ч / фут примерно 30 КОЕ / эмбрион, доза, которая вызывала 50% летальности после 20 hpi (Suppl. Fig. S1). Для каждой обработки вводили 35–40 эмбрионов, и эксперимент повторяли, по меньшей мере, в четыре раза. Чтобы сравнить восприимчивость к PAO1-инфекциям WT и CF, мы инфицировали оба типа эмбрионов и проанализировали летальность при 20 hpi. Как и ожидалось, эмбрионы CF были более восприимчивы к инфекции PAO1, так как они демонстрировали очень значительную повышенную летальность по сравнению с WT (83 ± 9% против 66 ± 6% соответственно) при 20 hpi (Fig. 3a).

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Эффективность фаговой терапии у рыбок данио. (a) Летальность при 20 hpi у эмбрионов WT и CF рыбок данио, инфицированных PAO1 (+ PAO1) и обработанных коктейлем фага (+ PAO1 + ϕ). Среднее значение и SD сообщаются из шести и четырех экспериментов соответственно, каждый с 25-40 эмбрионами. Угловое преобразование применяли к проценту летальности, а односторонний ANOVA с последующим тестом Дункана использовали для проверки значимости. (WT + PAO1) против (WT + PAO1 + ϕ) p = 0,004; (WT + PAO1) против (CF + PAO1) p = 0,0003; (CF + PAO1) против (CF + PAO1 + ϕ) p = 0,018. (б) Бактериальная нагрузка у эмбрионов WT или CF, инфицированных PAO1 или PAO1 + ϕ. Приводится относительный процент КОЕ / эмбрионов в эмбрионах PAO1 + ϕ и PAO1. Среднее и SD трех независимых экспериментов сообщается. (c, d) Прогрессирование инфекции у эмбрионов WT (c) и CF (d) после инъекции PAO1 (верхний эмбрион) и эффективность фаговой терапии у эмбрионов с инъекцией PAO1 + ϕ (нижний эмбрион) в 4, 9, 14 и 18 л / с (e) Уровни экспрессии генов TNF-α и IL-β, измеренные с помощью RT-КПЦР при 8 hpi у эмбрионов WT (e) и CF (f), инъецированных при 48 hpf. Среднее и SD четырех экспериментов сообщается. Статистическую значимость оценивали с помощью ANOVA с последующим тестом Дункана: (e) для TNF-α, (WT) против (WT + PAO1) p = 0,0018; (WT) против (WT + PAO1 + ϕ) p = 0,007; (WT + PAO1) против (WT + PAO1 + ϕ) p = 0,22 нс .; для IL-β (WT) против (WT + PAO1) p = 0,0002; (WT) против (WT + PAO1 + ϕ) p = 0,0001; (WT + PAO1) против (WT + PAO1 + ϕ) p = 0,94 н.с .; (f) для TNF-α, (CF) против (CF + PAO1) p = 0,015; (CF) против (CF + PAO1 + ϕ) p = 0,019; (CF + PAO1) против (CF + PAO1 + ϕ) p = 0,77 нс .; для IL-β (CF) против (CF + PAO1) p = 0,00014; (CF) против (CF + PAO1 + ϕ) p = 0,0007; (CF + PAO1) против (CF + PAO1 + ϕ) p = 0,031. Для простоты на фигурах * р <0,05; ** р <0,01, *** р <0,001.

Четыре фага нашей коллекции, способные инфицировать штамм PAO1, были выбраны для смешивания в коктейле. Описание фагов приведено в таблице S1. Мы предварительно оцениваем активность фагового коктейля при лечении инфекции PAO1 у личинок G. mellonella. Мы наблюдали, что летальность инфицированных PAO1 личинок при 20 hpi значительно снижалась с 66 ± 3% до 46 ± 6% при лечении коктейлем фага (Suppl. Fig. S2), подтверждая тем самым, что коктейль фага был активен против острых инфекций PAO1.

Затем, чтобы проверить эффективность фаговой терапии у рыбок данио, мы вводили тот же самый фаговый коктейль эмбрионам WT, инфицированным PAO1; инокулят из 2 нл фагового коктейля, содержащий приблизительно 300-500 единиц, образующих бляшки (pfu) / эмбрион, инъецировали в желточный мешок зародышей, инфицированных PAO1 (PAO1 + ϕ), в два разных момента времени: около 30 минут ( рано) и через 7 часов (поздно) после бактериальной инъекции. При значительном снижении летальности эмбрионов наблюдалось время инъекции: летальность снизилась с 70 ± 12% до 42 ± 9% и до 38 ± 3% при раннем и позднем введении, соответственно (Suppl. Fig. S3). Поскольку значительных различий не наблюдалось, дальнейшие анализы проводились с ранним временем заражения.

Фаговую терапию против инфекции PAO1 применяли как к эмбрионам WT, так и к CF; наблюдалось значительное снижение летальности (с 66 ± 6% до 35 ± 12% для WT и с 83 ± 9% до 52 ± 7% для эмбрионов CF. Рис. 3a), что указывает на эффективность фаговой терапии у рыбок данио как в WT и в фоновом режиме. Мы также определили бактериальную нагрузку у эмбрионов WT и CF через 8 hpi после введения фагом: после обработки фагом наблюдалось снижение среднего КОЕ / эмбрион до примерно 20% (рис. 3b). Чтобы проследить прогрессирование инфекции PAO1 и эффективность фаговой терапии, мы провели анализ временных интервалов эмбрионов WT и CF, которым инъецировали PAO1 и PAO1 и фаги. Как показано на рис. 3в, у эмбрионов, инъецированных WT + PAO1 (вверху), флуоресценция увеличилась при 14 hpi и 18 hpi, что указывает на то, что GFP-позитивные бактерии размножаются, тогда как у эмбрионов WT + PAO1 + ϕ (внизу) флуоресценция не увеличивалось, вероятно, как результат антибактериальной активности фага. Те же результаты в отношении эффективности фаговой терапии были получены на фоне МВ, но, как и ожидалось, уровни бактериальной инфекции у эмбрионов CF + PAO1 были выше по сравнению с эмбрионами WT + PAO1 (Рис. 3d, и Видео S2 и S3). Мы также проверили противоспалительный ответ, измеряя экспрессию цитокинов TNF-α и IL-β с помощью RT-qPCR (Fig. 3e, f). Противоспалительный иммунный ответ активировался как при WT, так и при CF-инфекциях (WT + PAO1 и CF + PAO1) при 8 hpi; инъекция фагового коктейля вызывала небольшое снижение экспрессии цитокинов, которое было значительным только для IL-β на фоне CF.

Анализ влияния фагов на иммунный ответ

В отсутствие бактериальной инфекции PAO1, чтобы лучше понять, могут ли фаги вызывать per se иммунную реакцию, мы измерили экспрессию TNF-α и IL-β в эмбрионах WT и CF без (WT и CF) или после введения фага (WT). + Φ и CF + ϕ) при 20 hpi. Интересно, что мы обнаружили, что экспрессия TNF-α и IL-β была значительно выше у эмбрионов CF по сравнению с WT (Fig. 4). Эти данные указывают на то, что снижение активности Cftr само по себе определяет конститутивное воспалительное состояние. К нашему удивлению, у эмбрионов CF + ϕ мы наблюдали снижение экспрессии обоих цитокинов, что позволяет предположить, что фаговый коктейль может оказывать благоприятное воздействие против конститутивного воспаления эмбрионов CF (Fig. 4). Следует отметить, что повышенная экспрессия IL-β, но не TNF-α, наблюдалась также у эмбрионов WT + ϕ.

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Экспрессия TNF-α и IL-β у фаговых инъецированных эмбрионов WT и CF. Уровни экспрессии генов TNF-α и IL-β, измеренные с помощью RT-qPCR при 20 hpi у эмбрионов WT, WT + ϕ, CF и CF + ϕ, инъецированных при 48 hpf. Среднее и SD четырех экспериментов сообщается. Статистическую значимость оценивали с помощью ANOVA с последующим тестом Дункана: для TNF-α (WT) против (WT + ϕ) p = 0,96 н.с .; (WT) против (CF) p = 0,022; (CF) против (CF + ϕ) p = 0,23 н.с. Для IL-β (WT) против (WT + ϕ) p = 0,020; (WT) против (CF) p = 0,00007; (CF) против (CF + ϕ) p = 0,009.

Эффект от сочетания фаговой и антибиотикотерапии

Поскольку одной из основных проблем у пациентов с МВ является хроническая бактериальная инфекция и развитие устойчивости к антибиотикам, мы проверили эксперимент с сочетание фаговой терапии и лечения антибиотиками путем инкубации эмбрионов CF + PAO1 в воде рыбы, содержащей 100 мкг / мл ципрофлоксацина (ципро) антибиотик, обычно используемый против инфекций P. aeruginosa. Эмбрионы CF, инфицированные PAO1 и обработанные либо антибиотиком (PAO1 + ципро), либо коктейлем фага (PAO1 + ϕ), показали пониженную летальность по сравнению с эмбрионами CF + PAO1. Интересно, что комбинированное лечение фагами и ципрофлоксацином (CF + PAO1 + ϕ + cipro) еще больше снижало летальность по сравнению с эмбрионами, обработанными любым из двух (Fig. 5).

Фаги против Pseudomonas aeruginosa (рыбки данио-рерио)
Комбинация фаговой терапии и лечения ципрофлоксацином у эмбрионов МВ. Эмбрионам 48 hpf инъецировали PAO1 (CF + PAO1) с последующей инъекцией фагового коктейля (CF + PAO + ϕ) или инкубацией в рыбной воде, содержащей 100 мкг / мл ципрофлоксацина (CF + PAO + cipro) или обоих (CF + Pao + ф + Ципро). Летальность определялась при 20 л / с. Среднее и SD трех экспериментов сообщается, каждый с 25-40 эмбрионов / лечение. Угловое преобразование применяли к проценту летальности и использовали односторонний ANOVA с последующим тестом Даннетта. Значения p приведены для каждой обработки по сравнению с CF + PAO1: CF + PAO + ϕ, p = 0,043; CF + PAO + Cipro, p = 0,014; CF + PAO + ϕ + Cipro, p = 0,005.

Обсуждение

В этой работе мы продемонстрировали, что фаговая терапия способна бороться с инфекциями P. aeruginosa у эмбрионов рыбок данио. Эмбрионы рыбок данио приобретают популярность в качестве моделей заражения такими патогенами, как P. aeruginosa. Недавно фаговая терапия была применена для лечения экспериментально индуцированных инфекций рыбок данио, вызываемых патогеном рыб Aeromonas hydrophila. Недавно мы показали, что фаговая терапия излечивает острую респираторную инфекцию P. aeruginosa у мышей и замедляет летальность у личинок восковой моли G. mellonella. В этой работе мы расширим репертуар моделей инфекции, в которых фаговая терапия против P. aeruginosa была протестирована и доказала свою эффективность, что является актуальной проблемой, учитывая широкую вариабельность вирулентности, продемонстрированную штаммами P. aeruginosa у разных хозяев.

Использование GFP-экспрессирующих бактерий в сочетании с прозрачностью эмбрионов рыбок данио позволило нам следить за бактериальной инфекцией в режиме реального времени. Действительно, мы наблюдали, что у инфицированных эмбрионов, которые выживают при 20 hpi, GFP-позитивные бактериальные очаги присутствовали в разных районах эмбрионов, что указывает на то, что бактерии, инъецированные в проток Кювье, распространяются по всему эмбриону и заражают различные органы. Кроме того, бактерии размножаются в эмбрионе, как показано с помощью анализа временных интервалов эмбрионов, инъецированных PAO1 (см. Рис. 3c, d и видео S2 и S3), и инициируют образование микроколоний, предшественников биопленки.

В наших экспериментах очень низкий инокулят бактерий (30 КОЕ / эмбрион) был смертельным для эмбрионов рыбок данио. Этот результат отличался от предыдущих наблюдений, проведенных Ламасом и Ван дер Саром и его коллегами, которые выполняли тот же тип инфекции с более высокой дозой бактерий (более 500 КОЕ / эмбрион). Штамм бактерий PAO1, использованный для инфекции, и протоколы были одинаковыми, поэтому мы предполагаем, что различный ответ на инфекцию может быть вызван различиями, накопленными в штаммах PAO1, обычно используемых в разных лабораториях, как ранее было продемонстрировано.

Мы обнаружили, что фаговая терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa также в модели CF у рыбок данио, полученной с помощью техники потери функции cftr. Насколько нам известно, это первый раз, когда фаговая терапия успешно применяется в модельной системе CF in vivo. Для изучения патофизиологии МВ было разработано несколько моделей на животных, включая мышь, свинью и хорька. У мышиных моделей развивается кишечная непроходимость, подобная пациентам с МВ, но у них не развивается спонтанное заболевание легких, и они представляют только легкое заболевание поджелудочной железы, вероятно, из-за компенсаторных кальций-активированных хлоридных каналов. Модели CF у хорьков и свиней развивают патофизиологическую характеристику CF во многих органах, включая легкие и поджелудочную железу, но они представили ограниченную доступность стадий развития, высокие затраты на животноводство и неосуществимость генетического анализа. Несмотря на то, что лишенный легких, которые являются основными органами, пораженными инфекциями P. aeruginosa, у пациентов с МВ, у рыбок данио недавно появилась мощная система генетической модели, позволяющая лучше понять возникновение МВ и разработать новые фармакологические методы лечения.

Действительно, генетическая способность эмбрионов рыбок данио точно анализировать функцию генов, их оптическая прозрачность, которая облегчает визуализацию развития или прогрессирования инфекции в реальном времени, делают рыбку данио подходящей моделью МВ, а также отсутствие адаптивного иммунного ответа у эмбрионов до 30 дней29. делает рыбок данио идеальной моделью для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом при инфекциях легких человека. Как уже было показано, фон МВ более чувствителен к инфекциям P. aeruginosa PAO1, чем WT21. Действительно, мы наблюдали более высокую летальность и повышенную бактериальную пролиферацию у эмбрионов CF + PAO1 по сравнению с WT + PAO1. Кроме того, после бактериальной инфекции у эмбрионов CF наблюдается задержка провоспалительного ответа по сравнению с WT, что свидетельствует о нарушении иммунного ответа из-за отсутствия функции Cftr.

Интересно, что мы также наблюдали, что в отсутствие индуцированной инфекции PAO1 у эмбрионов рыбок данио цитокины TNF-α и IL-β были значительно активированы по сравнению с WT, что позволяет предположить, что отсутствие функции Cftr само по себе вызывает конститутивное воспаление. состояние, подобное тому, которое присутствует у пациентов с МВ. Действительно, предыдущие исследования с использованием эпителиальных клеток от пациентов с МВ показали чрезмерную экспрессию провоспалительных цитокинов в отсутствие функции CFTR. Мы также продемонстрировали, что на фоне МВ введение коктейля фагов без бактериальной инфекции снижало экспрессию TNF-α и IL-β до уровня, более сходного с эмбрионами WT. Возможно, что фаги, помимо противодействия бактериальным инфекциям, убивая бактерии, могут проявлять вторичную функцию, действуя как иммуномодуляторы. На самом деле, конститутивное воспалительное состояние эмбрионов CF было снижено с помощью инъекции фага, в то время как у сибса WT инъекция фага определяет увеличение экспрессии цитокинов. Это говорит о том, что фаги сами по себе могут активировать мягкий иммунный ответ, но, когда присутствует конститутивное воспаление, как на фоне МВ, конечный эффект фагов не противоспалительный. Эта гипотеза была ранее высказана Горски и его коллегами, которые сообщили, что фаги связываются с клетками млекопитающих, включая лимфоциты, и вызывают иммуносупрессивные эффекты, которые увеличивают выживаемость аллогенного кожного аллотрансплантата у мышей. Более того, эти эффекты сопровождались фаго-опосредованным ингибированием аллоантиген-индуцированных человеческих Т- и В-клеточных ответов in vitro, а также продукцией специфических антител у мышей. Таким образом, возможность использования фагов в качестве противовоспалительных агентов у пациентов с МВ может быть оценена.

У эмбрионов рыбок данио мы наблюдали положительное взаимодействие между фаговой и антибиотикотерапией, так как летальность снижалась, когда фаг и ципрофлоксацин вводили в комбинации с PAO1-инфицированными эмбрионами в отношении отдельных введений. В других исследованиях было доказано, что комбинированное действие фагов и антибиотиков помогает бороться с инфекциями, вызываемыми различными патогенными микроорганизмами, включая мультирезистентные штаммы. Таким образом, комбинация фаговой терапии и введения антибиотиков представляется в качестве многообещающего терапевтического подхода, особенно в целях уменьшения доз антибиотиков и продолжительности лечения.

Методы

Бактериальный штамм.
Штамм P. aeruginosa PAO1-GFP (обозначенный как PAO1) был сконструирован в нашей лаборатории путем трансформации PAO1 плазмидой, обеспечивающей устойчивость к карбенициллину и экспрессирующей GFP. Штамм можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для заражения культуры PAO1 выращивали при 37 ° С со встряхиванием до OD600 = 0,5, что соответствует примерно 5 × 108 КОЕ / мл в бульоне LD53, добавленном с карбенициллином (300 мкг / мл), осаждали и ресуспендировали в том же объеме физиологического раствора. решение. Разведения использовали для микроинъекций в эмбрионах рыбок данио.

Фаговый коктейль
Вирулентные фаги, которые заражают PAO1, использованный в этой работе, были выделены и охарактеризованы ранее. Были выбраны четыре фага: два Podoviridae, регистрационные номера GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 и vB_PaeP_DEV, MF490238 и два Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 и vB_PaeM_E217, MF. Подробная информация о фагов сообщается в Suppl. Таблица S1. Каждый лизат фага выращивали и очищали, как описано Forti et al. Вкратце, лизаты с высоким титром культур PAO1 фильтровали через фильтры диаметром 1,2 мкм, инкубировали с ДНКазой (1 мкг / мл) и РНКазой (1 мкг / мл), осаждали ПЭГ, дважды очищали ультрацентрифугированием в хлориде цезия и диализовали против буфера TN. (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7), перед удалением эндотоксина (EndoTrap HD, Hyglos, Германия) с последующим измерением уровня эндотоксина с помощью количественного определения LAL хромогенного эндотоксина (Pierce). Фаговый коктейль собирали путем смешивания четырех препаратов фагов в одной и той же БОЕ / мл непосредственно перед каждым экспериментом для обеспечения точных титров фагов.

Модель данио
Эмбрионы данио рерио (Danio rerio) выращивались и содержались в стандартных условиях в рыбном хозяйстве Cogentech s.c.a.r.l. (Aut. Prot. N. 007894 – 29/05/2018), через Adamello 16 – 20139, Милан (Италия). В соответствии с международными (Директива ЕС 2010/63 / EU) и национальными руководящими принципами (итальянский указ от 4 марта 2014 года, № 26) о защите животных, используемых в научных целях. Эксперименты с рыбками данио регулируются экспериментами на животных начиная с 120 часов после оплодотворения. В этой работе мы использовали исключительно эмбрионы рыбок данио до 120 hpf. Штаммы Zebrafish AB, полученные из лаборатории Вильсона, Университетский колледж Лондона, Лондон, Соединенное Королевство, поддерживали при 28 ° С в течение 14 ч цикла свет / 10 ч темноты. Эмбрионы собирали естественным нерестом, организовывали в соответствии с Kimmel et al. и выращивали при 28 ° C в воде рыбы (Instant Ocean, 0,1% Methylene Blue) в чашках Петри в соответствии с установленными методами. Через 24 часа после промедления для предотвращения пигментации в рыбу добавляли 0,003% 1-фенил-2-тиомочевины (PTU, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Эмбрионы промывали, дехорионировали и анестезировали 0,016% трикаином (соль метансульфоната этил-3-аминобензоата; Sigma-Aldrich) перед наблюдением и получением изображений. Введение антибиотика осуществляли путем добавления ципрофлоксацина непосредственно в воду рыбы в концентрации 100 мкг / мл сразу после бактериальной инъекции. Для анализа гибридизации in situ эмбрионы фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (Sigma-Aldrich) в физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS; Sigma-Aldrich) при 4 ° C, затем поэтапно дегидратировали до метанола и хранили при -20 ° C.

Эмбрионы рыбок данио с потерей функции (CF эмбрионы)
Инъекции антисмыслового олигонуклеотида морфолино проводили на эмбрионах на 1-2 клеточной стадии; в случае необходимости также вводили краситель, родамин-декстран. Для подавления трансляции мРНК cftr использовали cftr-ATG-MO и cftr-splice-MO (Gene Tools LLC, Philomath, OR), как описано ранее21. Морфолино вводили в 1х буфере Данио (рН 7, 6). В качестве контроля (WT) мы вводили стандартный контрольный морфолино-олигонуклеотид, который не имеет мишени у рыбок данио (Gene Tools LLC).

Заражение эмбрионов рыбок данио PAO1 и фагами
Заражение PAO1 проводили у эмбрионов рыбок данио в 48 часов после оплодотворения путем микроинъекции 2 нл бактериальной суспензии, содержащей приблизительно 30 КОЕ / эмбрион, в проток Кювье, как описано ранее. Оценка бактериальной инфекции проводилась в соответствии с рекомендациями Такаки и его коллег. Для титрования инъецированных бактерий наносили одинаковый объем бактериальной суспензии для определения КОЕ; Титр инъецированных бактерий определяли в среднем по восьми независимым показателям. Фаговый коктейль (2 нл при 5 × 108 БОЕ / мл) микроинъецировали в желток после бактериальной инъекции, и титр фага рассчитывали так же, как и для бактерий. Были протестированы разные сроки введения коктейля фагов: ранний (около 30 мин) и поздний (7 ч) с похожими результатами. В большинстве экспериментов мы использовали раннюю инъекцию по практическим соображениям. В каждом эксперименте вводили 25-40 эмбрионов для каждой отдельной обработки, и каждый эксперимент повторяли по меньшей мере три раза.

Следовали указаниям по визуализации взаимодействия между хозяином и бактериями: макрофаги визуализировали путем инъекции конструкции tol2 (mpeg1: mCherry) на одноклеточной стадии, как описано Ellet и коллегами58. Чтобы визуализировать образование микроколоний, около 100 КОЕ PAO1 инъецировали в желудочек заднего мозга эмбрионов рыбок данио 24 hpf, как выполнено Rocker и коллегами. Мы рассмотрели микроколонии бактериальных агрегатов площадью> 5 мкм.

Определение бактериальной нагрузки
Эмбрионы, инъецированные PAO1, инкубировали при 28 ° C в течение 8 hpi. 20 эмбрионов в 3 различных экспериментах были механически гомогенизированы с помощью шприца с инсулином, и полученный гомогенат серийно разводили и высевали для расчета бактериального титра. Чтобы ограничить рост других бактериальных штаммов, присутствующих в зародышах, в среду добавляли ампициллин (100 мкг / мл), чтобы отобрать штамм PAO1, устойчивый к натуральной амплификации.

Определение уровня экспрессии генов противоспалительных цитокинов
Уровень экспрессии генов TNF-α и IL-β определяли с помощью методов обратной транскрипции-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Общая РНК была извлечена из эмбрионов рыбок данио при 8 и 20 hpi с использованием реагента Тризол (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. После обработки РНКазой без ДНКазы I (Roche Diagnostics, Basel, Swiss) во избежание возможного геномного загрязнения 1 мкг РНК подвергали обратной транскрипции с использованием «Системы обратной транскрипции ImProm-II ™» (Promega, Madison, Wisconsin USA) и смесь олиго (dT) и случайных праймеров в соответствии с инструкциями производителя. КПЦР проводили в общем объеме 20 мкл, содержащем 1X iQ SYBR Green Super Mix (Promega), используя надлежащее количество ОТ-реакции. qPCR были выполнены с использованием системы обнаружения в реальном времени BioRad iCycler iQ (BioRad, Hercules, CA, USA). Условия термоциклирования: 95 ° С в течение 10 мин, 95 ° С в течение 10 с и 55 ° С в течение 30 с. Все реакции проводили в трех повторениях в течение 40 циклов. Для целей нормализации уровни экспрессии rpl8 тестировали параллельно с представляющим интерес геном. Были использованы следующие праймеры:
TNF-α Fw 5′-TGCTTCACGCTCCATAAGACC3′;
TNF-α Rev 5′-CAAGCCACCTGAAGAAAAGG-3′;
IL1-β Fw 5′-TGGACTTCGCAGCACAAAATG-3′;
IL1-β Rev 5′-CGTTCACTTCACGCTCTTGGATG-3′;
rpl8 Fw 5′-CTCCGTCTTCAAAGCCCAT-3′;
rpl8 Rev5′-TCCTTCACGATCCCCTTGAT-3′.

Анализ гибридизации
Эксперименты по гибридизации in situ (WISH) проводили, как описано Тиссе и его коллегой. Антисмысловые рибопробы ранее были in vitro помечены дигоксигенином (Roche Diagnostics). Датчики cmlc2 (myl7, информационная сеть данио рерио) и prox1 были описаны ранее. Изображения эмбрионов и срезов получали с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой с программным обеспечением для визуализации LAS Leica (Leica, Wetzlar, Germany). Изображения обрабатывались с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop, и при необходимости различные плоскости фокусных изображений одного и того же изображения брались отдельно, а затем объединялись в одно изображение.

Обработки изображений
Для конфокальной визуализации в реальном времени эмбрионы в 54 hpf были установлены в чашку Петри со стеклянным дном с 1,5% легкоплавкой агарозой в воде рыбы с PTU и анестезирующим препаратом Трикаин, и немедленно визуализированы на конфокальном инвертированном микроскопе SP2 (Leica, Wetzlar , Германия) с объективом HC PL APO 10x и аргоновым лазером 488 нм для GFP и 587 нм для Мчерри. Были получены серии z-стеков по 300 мкм каждые 15 минут. Кадры, полученные в результате получения конфокального микроскопа, были собраны и преобразованы в видео в формате AVI с использованием программного обеспечения ImageJ. При необходимости изображения вырезали и собирали в соответствии с правильной ориентацией и расположением эмбрионов.

Статистический анализ
Угловое преобразование было применено к данным о летальности и преобразованным данным, проанализированным t или ANOVA Стьюдента, после чего, при необходимости, был выполнен специальный тест Дункана или Даннетта. Уровень экспрессии генов цитокинов анализировали по методу Стьюдента или ANOVA. Все анализы проводились с использованием программного обеспечения STATISTICA v. 7.0.

Доступность данных
Наборы данных, сгенерированные во время и / или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.

0

Автор публикации

не в сети 1 месяц

Юстас

Аватар 15
Комментарии: 7Публикации: 330Регистрация: 01-07-2019

Добавить комментарий

Авторизация
*
*
Регистрация
*
*
*
Генерация пароля